Untitled Document

SZÜLÉSZETI ÉS SZAPORODÁSBIOLÓGIAI ISMERETEK KUTYATENYÉSZTŐKNEK

VI. A kutya mesterséges termékenyítése és a sperma tartós tárolásának lehetőségei

Sokak számára unalmasan cseng: mesterséges termékenyítés és már lapoznak is tovább. "Mi újat tudnak nekem mondani, hiszen évek óta magam is alkalmazom?" Mások számára egyenértekű a legrosszabbal, ami történhet tenyészetükben, hiszen sohasem született belőle kölyök, és különben is: "az a kan már sohasem fedez úgy, ha egyszer spermát vettek tőle"-állítják magabiztosan. Érvek és ellenérvek, hiedelmek és tények egy olyan beavatkozással kapcsolatban, melynek alkalmazása ma már kizárólagosságot nyert egyes állatfajoknál, és humán viszonylatban pedig, gyermekek százai köszönhetik létüket ennek a legrégebbi biotechnológiai módszernek, melynek neve: mesterséges termékenyítés. Tényleg mi is a helyes? Mesterséges termékenyítés vagy mesterséges megtermékenyítés? Tegyük hát helyére a kifejezéseket: a mesterséges termékenyítés, ami az ember által végzett "beondózást" jelenti, a helyesen használt fogalom a beavatkozásra. Hiszen nem biztos, hogy meg is termékenyül az a petesejt tevékenységünk eredményeképpen. A megtermékenyítés fogalma a sejtszinten végbemenő eseményekre értendő, azt a történést nevezzük így, amikor a spermium behatol a petesejt burkába és átadja genetikai állományát a petesejtnek, beindítva ezzel az osztódási folyamatokat.
Térjünk hát vissza a kutyák mesterséges termékenyítéséhez és a spermatárolás lehetőségeihez, kezdve talán egy kis történeti áttekintéssel, melyből kiderül, hogy ez az eljárás sokkal régebbi, mint gondolnánk.

Egy kis történelem...

Amikor több mint 200 évvel ezelőtt, 1779-ben az olasz Lazzaro Spallanzani először vett spermát kutyától és azt mesterséges termékenyítésre használta, nem gondolhatta, hogy az általa sikeresen alkalmazott módszer majdnem két évszázadra a feledés homályába merül az említett fajnál. Bár a gazdasági haszonállatok esetében a mesterséges termékenyítés és a hozzá kapcsolódó spermavételi és tartósítási módszerek (spermahígítás, spermamélyhűtés) már a múlt század derekán (1940-50-es évek) bevezetésre kerültek a rutin állattenyésztésbe, a kutya esetében csak 1956-ban találunk leírást a módszer alkalmazásáról, miszerint Harrop angol állatorvos Angliából származó hígított-hűtött kutyaspermával termékenyített szukákat USÁ-ban, a Cornell Egyetemen. Az első spermakonzerválási kísérletek is Amerikából származnak és 1969-70-ben már sikeres termékenyítésekről is beszámoltak, vagyis megszülettek az első mélyhűtött spermából származó almok. A növekvő tenyésztői érdeklődés hatására megjelentek az első spermabankok és genetikai centrumok, melyek tevékenységi köre kiterjed a tenyészkanok andrológiai vizsgálatára, a sperma levételére, vizsgálatára, mélyhűtésére, tárolására, szállítására, a tenyészszukák ovuláció-diagnosztikájára, valamint az inszeminálások végrehajtására és azok regisztrálására.

A magyar valóság...

Magyarországon kb. a 80-as évek vége óta végeznek mesterséges termékenyítést kutyákon. Az elvégzett inszeminálások 99%-a friss, hígítatlan spermával történik, közvetlenül a spermavétel után, és az esetek 80%-ban a módszer alkalmazásának az oka, hogy a kan vagy a szuka nem hajlandó a párzásra. Tapasztalataink szerint a mesterséges termékenyítés a kutyatenyésztői társadalomban felemás megítélés alá esik, és gyakran azt csak végső megoldásként választják; így a szaporodásbiológiai szempontból "problémás esetek" nagy száma rontja a hazai vemhesülési statisztikát ( 55-60%), mely elmarad nemzetközi viszonylatban a friss spermával végzett inszeminálások fogamzási arányától (kb. 75-80%). A tenyésztői szervezetek tudomásunk szerint- se nem tiltották se nem szorgalmazták a mesterséges termékenyítés alkalmazását, és így a módszer állategészségügyi (járványügyi) és tenyésztési kontrolja egyaránt elmaradt, hiszen nem valósult meg a spermadonorok egyedi azonosítása mikrochip vagy DNS vizsgálat alkalmazásával, és kérdéses maradt inszeminálásból származó almok törzskönyvezése is. A szabályozatlan helyzet nem kedvezett a spermamélyhűtés és spermabankok kialakulásának sem, hiszen bizonytalan volt a spermadonor halála után a konzervált spermából születendő almok regisztrálása is. És ez bizony csak a kérdések és rendezésre váró problémák egy része. Csak összehasonlításul: ma az USÁ-ban és Kanadában szinte azonos arányban alkalmazzák a mesterséges termékenyítést, mint a természetes fedeztetést, és hozzávetőlegesen hasonló eredményességgel. Nagyon elterjedt a spermatranszport országon belül és országok között is. Európában köztudottan Skandinávia vezet e beavatkozás alkalmazásában és a mesterséges termékenyítésből származó almok regisztrálás is a legnagyobb gondossággal folyik. Kétségtelen, hogy ezek az országok az állategészségügyi korlátok miatt (karantén szabályok) tenyésztési szempontból kissé kirekesztett helyzetben lennének a mesterséges termékenyítés, spermatranszport és a spermamélyhűtés felkarolása nélkül.

A kutyasperma tartós tárolása és a felhasználás módjai

A spermakonzerválásnak két formáját alkalmazhatjuk kutyasperma esetében: a folyékony-hűtött és a mélyhűtött formában való tárolást. A kutyasperma viszonylag érzékeny a környezet hőmérsékleti hatásaira, kezelése során óvni kell a "hideg-shock-tól", és fontos a frakcionált sperma vétel alkalmazása, ami azt jelenti, hogy az eltarthatóságot csökkentő prosztataváladék ne kerüljön a spermába. A levétel után a kezeletlen, natív sperma kb. 12 h-ig életképes, de rohamosan csökken a mozgó spermiumok aránya. A tartósítás céljából a spermához speciális anyagokat kell hozzáadnunk. Ezeket nevezzük spermahígítóknak, melyek alkalmazásával a sejtek életfunkciói hosszabb-rövidebb távon megőrizhetőek. A hígítók izotóniás, izoozmotikus, jó pufferkapacitású, tápláló és védő anyagokat tartalmaznak, és azonos hőmérsékleten a spermához adagolva csökkentik a sejtek energiafelhasználását, és lelassítják ill., kiegyensúlyozzák a spermiumok anyagcsere folyamatait, ezáltal meghosszabbítják a sejtek élettartamát. Mivel ezek a hígítók antibiotikumokat is tartalmaznak felhasználhatók bizonyos nemi úton, spermával terjedő bakteriális fertőzések átvitelének megakadályozására is.
A hűtött-hígított kutyasperma 4-7 C között 48-72 órán át tárolható a sejtek jelentősebb károsodása nélkül. Ennek a módszernek az előnye, hogy egyszerűen kivitelezhető, hiszen a levétel után, a spermavizsgálatot követően, csak lassan hozzá kell keverni a spermahígítót a spermához, majd kb. 30 percig szobahőmérsékleten való tárolás után be lehet helyezni az elegyet a 4-7 C körüli hűtőszekrénybe, vagy a hűtött szállító termoszba. Az ilyen módon kezelt szaporító anyag 2-3 napig eltartható, anélkül, hogy minősége jelentősen csökkenjen. Természetesen erre a célra csak a kiváló minőségű sperma használható fel, és jelentős eltarthatóságbeli különbségek lehetnek az egyes egyedek spermája között. A módszer előnye, hogy könnyen kivitelezhető, a hagyományos hüvelybe történő (un. intravaginális) termékenyítési (ld. Később) technikával inszeminálható a sperma, és nem igényel különösen pontos ovuláció diagnosztikát az eredményes felhasználása. A vemhesülés aránya megközelíti a 75-80%-ot. Hátránya viszont a rövid eltarthatósági idő, és spermatranszport esetén csak korlátozott távolságon belül alkalmazható. A szuka ciklusának vizsgálatakor az optimális termékenyítési időpontra ( progeszteron-szint kb.: 6-8ng/ml közötti) kell a spermatranszportot szervezni, aminek számos buktatója lehet. A felhasználása során az intravaginális termékenyítéskor a spermiumokat a hüvely mélyére, a méhszáj közelébe kell juttatni egy katéter segítségével, majd a szuka hátsó testfelét kb. 15 percig 45 -os szögben megemelve kell tartani, ezzel helyettesítve a természetes fedezéskor kialakuló "összeragadás" jelenségét. A beavatkozás során a gyakorlatban általában az egész ejakulátum inszeminálásra kerül, de hígított-hűtött spermánál is a sejtszám 200millió/ml sejt felett van. Lényeges a testhőmérsékletű eszközök és ondó használata, valamint a termékenyített sperma mennyisége lehetőleg ne haladja meg a 10ml-t, különben jelentős visszafolyás jelentkezik.

1. kép. Kutya mesterséges termékenyítésre szolgáló katéterek. Fent az un. Skandináv-katéterek (méhbe történő termékenyítéshez) különböző méretben, legalul, fecskendővel ellátva a hagyományos, intravaginalis termékenyítésre alkalmas katéter.

A genetikai állomány megőrzését szolgáló biotechnológiai eljárások közül a leginkább elterjedt, és a közvetlen tenyésztési gyakorlatban is alkalmazott módszer a sperma mélyhűtése, tárolása ill. a mesterséges termékenyítéssel történő felhasználása. A spermamélyhűtés és a génbankok létrehozása óriási tenyésztési lehetőségeket rejt magában, hiszen megvalósulhat:

" a genetikai anyag korlátlan ideig történő megőrzése, és felhasználhatósága az állat ideiglenes távolléte, betegség miatti fedezőképtelensége / terméketlensége vagy elhullása esetén.
" a programba bevont tenyészkanok folyamatos andrológiai és járványtani kontrollja
" a sperma szállítása (export-import) olyan országokba(ból), ahová élő állattal a helyi járványügyi előírások miatt nem juthat el a tenyésztő
" a szaporító anyag mindenkori ellenőrizhető felhasználása (pontos törzskönyvezés, korrekt származásellenőrzés)
" a tenyésztői munka segítése a genetikai előrehaladás felgyorsítása révén
" a kihalástól, genetikai sodródástól veszélyeztetett fajták, vonalak fenntartása.

A kutyasperma mélyhűtés a 1960-as évek végén, 70-es évek elején kezdődött, kísérleti körülmények között, elsősorban más állatfajok spermamélyhűtési technológiájának adoptálásával. Bár napjainkra a mélyhűtési protokoll és a használatos spermahígítók összetétele számos változtatáson esett át - figyelembe véve a kutyasperma faji sajátságait- a sperma felolvasztás utáni minősége (élettartam, motilitás, morfológia) és fertilitása (50-60%) elmarad más a állatfajoknál elért eredményektől, de méginkább a friss spermával történő termékenyítések eredményeitől (75-80%). A korábbi vizsgálatokból valószínűsíthetővé vált, hogy a gyengébb mélyhűthetőség hátterében az ondósejtek extrém "hideg-shock érzékenysége" áll, mely különösen a sejtmembrán sérüléseiben jelentkezik; valamint számottevő egyedi különbözőség tapasztalható az egyes donorok spermájának mélyhűtési toleranciájában is. A sejtek jelentős része (kb. 60%) morfológiai károsultnak bizonyul a felolvasztás után, és bár ezek a spermiumok mozognak, mégis a károsodott sejtmembrán miatt nem képesek a petesejt megtermékenyítésére. Erre a beavatkozásra csakis tökéletes minőségű sperma használható fel sikerrel. A mélyhűtésre történő előkészítés során a spermát 0,5 ml-es csövecskékbe, un. műszalmákba töltik, majd meghatározott hűtési protokoll szerint, folyékony nitrogén gőzzel -180 C-ra hűtik, végül -196 C-os folyékony nitrogénben tárolják. Ezen a hőmérsékleten a sejtek gyakorlatilag korlátlan ideig tárolhatók mindennemű károsodás nélkül.

Mikor érdemes a sperma mélyhűtését elvégeztetni?

Természetesen minden olyan körülmény, mely felfüggesztheti, vagy kizárhatja tenyészállatunkat a tenyésztésből (külföldi eladás, műtéti beavatkozás, betegség stb) indokolttá teszi genetikai anyagának megőrzését, a sperma mélyhűtését. A leglényegesebb azonban a génmegőrzés a jövő folyamatos és színvonalas tenyésztői munkája számára.
Klinikai tapasztalataink alapján a kanok spermaminősége a kor előrehaladtával folyamatosan romlik. Ez a változás általában nem feltétlenül jelentkezik azonnal a természetes fedeztetések eredményességének csökkenésében, hiszen a természet jelentősen "túlteljesít", vagyis sokkal nagyobb számú spermium kerül a fedezés során a szuka hüvelyébe, mint ahány már a biztos fogamzáshoz szükséges. Általában amikor a kan kutya tulajdonos érzékeli a szukák sorozatos "üresen maradását", akkor már késő; és jelentős gyakran visszafordíthatatlan spermaminőség romlás áll fenn az adott állatnál. Ezért javasolt az ígéretes tenyészállatok spermájának konzerválását még 3-4 éves korukban, de mindenképpen 5-6 éves kor előtt elvégeztetni, hiszen ilyenkor az általában még kiváló minőségű sperma jól tűri a mélyhűtés okozta károsodásokat, és felolvasztás után is megfelelő minőségű a termékenyítéshez.

A sperma felhasználása mesterséges termékenyítéssel történik, mely során az ondót a szuka méhébe (intrauterinális termékenyítés) kell helyezni. A kutya anatómiai sajátságai miatt ez általában műtéti úton valósítható meg, illetve kis és középtestű fajtáknál lehetőség van a műtét nélküli, hüvelyen keresztüli méhbe történő inszeminálásra (Skandináv katéter ld.1. kép). Az intrauterinális termékenyítésre azért van szükség, mert a felolvasztás után a spermiumok élettartama kb. 12 óra és mozgásuk energiaháttere is korlátozott, ezért a lehető legközelebb kell őket juttatni a megtermékenyítés helyszínéhez, a petevezetőhöz. A rövid spermium élettartam miatt, igen fontos a szuka pontos, progeszteron-szint mérésen alapuló ciklusdiagnosztikáját elvégeztetni.

A kutyasperma mélyhűtés korlátai és eredményességét befolyásoló tényezők

A kutyaspermium igen érzékeny a mélyhűtés/felolvasztás okozta káros hatásokra. A jelentős élettartam- és fertilitás csökkenés komolyan korlátozza a felhasználás módjait és lehetőségeit. A tenyészkan állomány spermája mélyhűthetőség szempontjából nagyon heterogén (szelekciós tevékenység a sperma mélyhűthetőségére eddig nem folyt).
A szukák sajátos ivari tevékenysége (tüzelés 6 havonta) korlátozza a termékenyítések gyakoriságát, ezért a tenyésztők nem szívesen vállalják ezt a drágább és kockázatosabb eljárást. A hosszú tüzelés ( 21nap) megnehezíti a termékenyítés optimális időpontjának meghatározását.
A felolvasztott sperma rövid élettartama ( 12 óra), erősen csökkent mozgási képessége (átlag 40%) és fertilitása ( 60%-ban károsodott sejtek) jelentősen rontja a fogamzási arányt. Az átlagos fogamzási arány az általunk előállított mélyhűtött sperma felhasználásával kb. 55%, mely világviszonylatban is megfelelőnek mondható. Számítani kell azonban az esetleges átlagosnál alacsonyabb alomszámokra (4-5 kölyök).
A spermiumok élettartam- és fertilitás csökkenése speciális intrauterin inszeminálási technika (általában sebészi) alkalmazását igényli ahhoz, hogy elfogadható fogamzási arányt és alomszámot lehessen elérni. Ez a tény jelenleg sokakat elrettent attól, hogy kedvencüket a mélyhűtött spermával történő termékenyítés procedúrája alá vessék. A beavatkozás azonban igen biztonságos altatási technika mellett történik, és semmiféle kockázatot nem jelent a szuka egészségére.

2.kép.: A sebészi úton történő intrauterinális mesterséges termékenyítés mélyhűtött spermával. A sperma méhbe juttatása.

A szerzők által 1997-től napjainkig 58 tenyészkan 85 ejakulátuma került mélyhűtésre és betárolásra a spermabankban. Ez igen jelentős számú (1000 feletti) műszalma tárolását jelenti, amely megközelítőleg 250 termékenyítési dózisnak felel meg. A spermadonorok életkori megoszlása jellemzően alakult, (1-3 év n=13; 3-5 év n=22; 5-8 év n=13; 8év< n=10), mely azt tükrözi, hogy a szolgáltatás hazai megítélése kissé felemás. A tenyésztők talán nem bíznak eléggé az eljárás korszerűségében és jövőjében, ezért inkább már a közép és idősebb korosztály mintegy utolsó megmentéseként igénylik a spermamélyhűtést. Ugyanakkor ismert az a megfigyelés, hogy a sperma mélyhűthetősége 5 éves életkor közelében gyorsan csökken.
Az említett időszak alatt itthon 10 termékenyítés történt sebészi módszerrel és ebből 7 szuka fogant (70% vemhesülés). A született alomszámok (2, 4, 2, 3, 7, 1, 6) átlaga 3,57, mely viszonylag alacsony, de a javuló ciklusdiagnosztika és a szukák előszelekciója, valamint a emelt termékenyítési spermiumszám kedvező tendenciót mutat. Az exportra kerülő spermákból 4 termékenyítés történt, de eddig ezekből külföldön nem született alom. A nem-sebészi termékenyítések (Skandináv katéter) még csak pár hónapja indultak és az alacsony esetszám miatt még nincs statisztikailag értékelhető adat.
Összefoglalónkkal talán sikerült érzékeltetni, hogy a kutyasperma tartós tárolásának a kutyatenyésztés fejlődésével egyre nagyobb jelentősége van, és a jövő tenyésztési lehetőségeinek a megteremtése a kezünkbe kerül, ha spermamélyhűtés alkalmazását választjuk, hogy büszkeségeink "halhatatlanokká" váljanak.

Dr. Szász Ferenc Ph.D. Dr. Gábor György Ph.D.
ANIREP Szaporodásbiológiai Szakrendelő
Budapest, 1119. Etele út 28.
Tel: 205-35-10, Mobil:06-20-31-22-440